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不僅操作麻煩，全自動氮吹儀而且成本很高，難于推廣。只有 耐熱 )*+聚合酶被發(fā)現(xiàn)后，聚合酶鏈反應才得到廣泛的應用。 / / B=C )*+聚合酶是目前應用最廣的耐熱性 )*+聚合酶，是從一種在 -DE-F G溫泉中生活的耐熱菌 中分離提純的，由 H60個氨基酸殘基組成的蛋白質。該酶在 IF G處理 0%經(jīng)過 FD個反應周期酶活性仍 可保持在很高水平。一次性加入可以滿足反應的全過程需要。 B=C )*+聚合酶大約有 ,J, DDD的錯配 率。目前已有高保真的 B=C )*+聚合酶。 / / ?@5可以在 )*+自動化擴增儀上很方便的進行。這種擴增儀可以根據(jù)輸入的正確程序，自動的快速 的改變溫度，調控各個循環(huán)周期中模板變性、模板和引物退火及引物延伸的溫度轉換，實現(xiàn)反應的自動化 操作。各種 ?@5反應的操作基本相同，反應體系中包括模板 )*+、兩種引物、四種 K*B?、B=C )*+聚合酶 和緩沖液。每個循環(huán)周期包括三個反應步驟： / / ,L )*+模板變性 //變性溫度一般為 IF G ,F8，待擴增的 )*+模板于高溫下變性，雙鏈解開，變成單鏈，作為聚合反應的 模板。 / / 0L模板與引物的退火 //退火溫度一般為 FFG 6D8。在退火過程中，引物分別與待擴增的 )*+片段的兩條鏈的 6M端互補配 #"!第三篇 !遺傳信息的傳遞 對。由于引物的濃度大于待測模板的濃度，引物與模板結合的概率遠大于模板的自身復性。 ! !"#引物的延伸 ! ! $%&酶的最適溫度為 ’( )，在此溫度下 $%&酶以單鏈 *+,為
模板將單核苷酸逐個加入到引物的 "端 ，使引物不斷延長，從而合成新的 *+,鏈。新合成的引物延伸鏈在下一輪循環(huán)時便可以作為擴增的模 板。引物延伸的時間一般為 .#/ 012以上，反應步驟的溫度和時間可以依據(jù)自己的試驗要求自行設定，一 般要經(jīng)過 (/ 3"4個循環(huán)。擴增產物需經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。 !!在第一個反應周期中，分別以互補的兩條 *+,鏈為模板，引物的延伸從模板的 "-端開始，這樣新合成 鏈的 /-端是一段引物的序列， "-端則長短不等，稱為“長產物片段”。從第二個反應周期開始，引物除與原 模板結合外，也與新合成的鏈結合。當引物與新合成的鏈結合時，由于新合成的鏈的 /-端序列是固定的， *+,聚合酶催化新鏈的延伸只能到此為止。這樣就出現(xiàn)了 /-端和 "-端分別對應兩種引物的產物片段，稱 為“短產物片段”。從第二個反應周期起，短產物片段以指數(shù)的方式增加，長產物片段每個周期只增加兩 個（圖 .’ 5）。經(jīng)過 (/ 3"4個循環(huán)后，短產物片段在反應體系中占有絕對優(yōu)勢，不必經(jīng)過提純即可用于 各種分析。
圖 .’ 5! 678工作原理及長片斷 9短片斷形成示意圖 ! ! 678的主要用途是擴增微量的 *+,，理論上只要有一條雙鏈 *+,作為模板，即可通過 678擴增到足 夠下一步試驗需要的 *+,量。 678的另一個主要用途是基因工程中獲得目的基因。通過 678獲得目的 基因要注意 $%& *+,聚合酶的錯配率，盡可能選用高保真的 $%& *+,聚合酶。 678的第三種主要用途是 通過檢測 08+,含量測定基因的表達水平。 678的第四種主要用途是進行定點突變。將待誘變的堿基 設計在引物中，當下一輪 678以引物延伸的鏈為模板擴增時， *+,的堿基就產生了定點突變。用這種方 第十七章 !基因技術#"! 法可以使蛋白質的氨基酸產生定向改變。 第四節(jié) ! !"#的序列分析 ! ! "#$序列分析主要有雙脫氧合成末端終止法和化學修飾法兩種方法。 圖 %& ’!雙脫氧末端終止法測序 #"!第三篇 !遺傳信息的傳遞 一、雙脫氧合成末端終止法 ! ! "#$%$#&’( )*+,$#的雙脫氧合成末端終止法實際上是一種試管內的復制 -./互補鏈并使之逐個核苷 酸延伸的比較分析方法。 ! ! -./序列分析除需要 -./的復制所必需的四個條件，即 -./聚合酶、單鏈 -./模板、帶有 01羥基的 引物、四種脫氧核苷三磷酸（ %/23 %223 %423 %523）外，還需要四種脫氧核苷三磷酸的類似物 61，01一雙 脫氧核苷三磷酸（%%.23）。%%.23能夠以它的 71磷酸和它上一位的核苷酸形成正常的 01，71磷酸二酯鍵， 但是 %%.23沒有 01羥基，下一個核苷酸不能與之形成 01，71磷酸二酯鍵，使
